Rychlá implementace návrhů průtokové cytometrie pomocí vysoce přesných modulů získávání dat

Průtokovou cytometrii široce využívají lékaři a diagnostici k analýze charakteristik buněk. V jedné buňce za druhou se kromě jiných atributů opticky vyhodnocuje hladina proteinů, zdraví krve, granularita a velikost buněk. Přestože se jedná o vysoce citlivé systémy, jsou konstruktéři cytometrů pod neustálým tlakem, aby zrychlili dobu analýzy, což vyžaduje nové přístupy k průtokové cytometrii a související elektronice.

Cytometry vystavují jednotlivé buňky laserovému světlu za účelem vytvoření rozptýlených a fluorescenčních signálů. K rychlému a přesnému zachycení výsledného světla a jeho převedení na digitální signály je zapotřebí lavinová fotodioda (APD) a složitá elektronika. Návrh a implementace obvodů pro tento proces může trvat dlouho, zejména vzhledem k tomu, že systémy pro získávání dat průtokové cytometrie vyžadují vysokorychlostní zařízení s nízkým šumem, aby byla zajištěna přesnost systému.

Konstruktéři mohou vyřešit problémy s rychlostí a přesností pomocí řešení získávání dat obsahujících interní ovladače zesilovače a analogově-digitální převodník (ADC), aby podpořili rychlejší analýzu průtokové cytometrie při zachování efektivní ceny.

V tomto článku je stručně nastíněno, jak fungují systémy průtokové cytometrie. Poté si zde představíme 18bitový modul ADC ADAQ23878 společnosti Analog Devices a ukážeme si, jak jej lze použít k návrhu stupně detekce a konverze průtokového cytometru. Představíme si také související vyhodnocovací sadu.

Moderní principy průtokové cytometrie

Moderní průtoková cytometrie je automatizovaný proces, který analyzuje buněčné a povrchové molekuly a charakterizuje a definuje různé typy buněk v heterogenní buněčné populaci. Nepočítáme-li dobu přípravy, která může být více než hodinu, přístroj provede tři až šest hodnocení charakteristik 10 000 jednotlivých buněk za méně než minutu.

K tomu, aby to bylo možné, je kritický krok přípravy jednotlivých buněk průtokové cytometrie. K organizaci vzorků dochází v nosné kapalině hydrodynamicky, aby se buňky nebo částice soustředily k analýze do úzkého proudu vzorku jednotlivých po sobě jdoucích buněk. Při této transformaci si jednotlivé buňky musí zachovat své přirozené biologické charakteristiky a biochemické složky.

Na obrázku 1 je ukázáno schéma přístroje průtokového cytometru, který začíná nahoře s vícebuněčným vzorkem.

Obrázek 1: Schéma průtokového cytometru od fokusace toku po získávání dat. (Zdroj obrázku: Wikipedia, upraveno Bonnie Baker)

Šest hlavních součástí průtokového cytometru tvoří průtoková cela, laser, lavinová fotodioda („avalanche photodiode“, APD), transimpedanční zesilovač („transimpedance amplifier“, TIA), ADC a počítač pro získávání a analýzu dat.

Průtokový cytometr má tok kapaliny nebo nosnou kapalinu, která se zužuje, aby během průchodu světelným paprskem nesla a vyrovnala buňky do jedné řady. Laserové světlo zachycuje jednu buňku po druhé a vytváří signál dopředně rozptýleného světla („forward-scattered“, FSC) a signál bočně rozptýleného světla („side-scattered“, SSC). Fluorescenční světlo je tříděno pomocí zrcadel a filtrů a poté zesíleno APD.

Dalším krokem je detekce, digitalizace a analýza výsledného světelného výstupu poté, co dopadne na APD. Pro vysokorychlostní TIA potřebný k detekci je ideální operační zesilovač LTC6268 500 MHz s ultra nízkým klidovým proudem, nízkým napěťovým šumem a FET vstupní strukturou od společnosti Analog Devices.

Obrázek 2: Obvod TIA využívá APD (PD₁) a operační zesilovač FET s nízkým vstupním proudem pro konverzi ultra nízkých fotodiodových proudů na výstupní napětí na IN1+. (Zdroj obrázku: Bonnie Baker)

Je nezbytné navrhnout tento obvod zesilovače s co největší šířkou pásma, takže parazitní kapacity musí být minimalizovány. Například parazitní zpětnovazební kapacita C ovlivňuje na obrázku 2 stabilitu obvodu a šířku pásma. Bez ohledu na volbu pouzdra rezistoru bude ve zpětné cestě zesilovače vždy existovat parazitní kapacita. Pro vysokorychlostní aplikace je však vhodnější pouzdro 0805, které má delší vzdálenost mezi koncovými krytkami a nejnižší parazitní kapacitu.

Zvětšení vzdálenosti mezi koncovými krytkami R₁ není jediným způsobem, jak snížit kapacitu. Dalším způsobem snížení kapacity mezi deskami je odstínit cesty pole E, které vedou ke vzniku parazitní kapacity, umístěním dodatečné uzemňovací trasy pod rezistor R₁ (obrázek 3).

Obrázek 3: Přidání uzemňovací trasy pod zpětnovazební rezistor odkloní pole E od strany zpětné vazby a svede je na zem. (Zdroj obrázku: společnost Analog Devices)

V tomto případě metoda konkrétně zahrnuje umístění krátké uzemňovací trasy pod a mezi podložky rezistoru poblíž výstupního konce TIA. Tato technika poskytuje hodnotu parazitní kapacity 0,028 pF se šířkou pásma TIA 1/(2π × R_F × C_PARAZITNÍ) rovnající se 11,4 MHz.

Optické světelné signály směřují k několika lavinovým diodám s příslušnými optickými filtry. Systémy APD, TIA a ADC převádějí tyto signály na jejich digitální reprezentaci a odesílají data do mikroprocesoru k další analýze.

Moderní přístroje mají obvykle více laserů a APD. Současná komerční zařízení mívají deset laserů a třicet lavinových fotodiod. Zvýšení počtu laserových a fotonásobičových detektorů umožňuje vícenásobné značení protilátek pro přesnou identifikaci cílových populací pomocí fenotypových markerů.

Rychlost analýzy však závisí na jemné rovnováze následujících faktorů:

• Rychlost nosné kapaliny
• Schopnost procesu hydrodynamického fokusu tvořit linie jednotlivých buněk
• Průměr tunelu
• Schopnost zachovat integritu buňky
• Elektronika

Akustická fokusace průtokové cytometrie

Zatímco přidání více laserů a APD urychluje analýzu a identifikaci, mohou v nejlepším případě nejnovější moderní průtokové cytometrické metody pro jednotlivé buňky získávat data až o jednom milionu jednotlivých buněk za minutu. V mnoha aplikacích, jako je detekce cirkulujících nádorových buněk přítomných v krvi v hladinách pouhých 100 buněk na mililitr, je to nedostatečné. V klinických aplikacích se zřídka se vyskytujícími buňkami vyžadují testy pravidelně časově náročnou analýzu miliard buněk.

Alternativou k procesu přípravy hydrodynamické fokusace buněk je proces akustické fokusace. Zde je piezoelektrický materiál, jako je zirkoničitan titaničitan olova (PZT), připevněn ke skleněné kapiláře, aby převedl elektrické impulzy na mechanické vibrace (obrázek 4a). Díky použití PZT k vibraci bočních stěn skleněné kapiláry na rezonanční frekvenci obdélníkové průtokové cely generuje systém různé akustické stojaté vlny s různým počtem tlakových uzlů.

Obrázek 4: Ilustrace akustické průtokové cely vyrobené s obdélníkovou skleněnou kapilárou (a). Umístění prvních tří tlakových uzlů pro kapiláru s pevnou šířkou (b). (Zdroj obrázku: Národní centrum pro biotechnologické informace („National Center for Biotechnology Information“))

Tyto frekvenční uzly PZT vyrovnávají proudící částice do několika samostatných proudnic (obrázek 4b). Akustická průtoková cela používá lineární stojatou akustickou vlnu k naladění na různé vlnové délky vytvořením jedné nebo více harmonií. Jak predikuje jednoduchý model lineární stojaté vlny, buňky ve vzorku vytvářejí v průtokové komoře jednu nebo více linií jednotlivých buněk.

Díky této přesné organizaci buněk se šířka tunelu nosné kapaliny může rozšířit, aby umožnila rychlejší průtoky kolem laserového paprsku (obrázek 5).

Obrázek 5: S rostoucí šířkou pouzdra u hydrodynamického vzorku (c. a d.) se vzorky buněk se rozptylují, což ztěžuje proces optického měření. Proudy akusticky fokusovaných vzorků (a. a b.) si zachovávají jednu řadu buněk bez ohledu na šířku pouzdra. (Zdroj obrázku: společnost Thermo Fischer Scientific)

Tradiční hydrodynamická fokusace (obrázek 5c.) uspořádává linie jednotlivých buněk při přípravě na laserové skenování. Zatímco širší trychtýř pro jádro vzorku proudu umožňuje vyšší rychlost materiálu nosné kapaliny (obrázek 5d.), má za následek také rozšíření organizace jednotlivých buněk, což vede ke změnám signálu a zhoršené kvalitě dat.

Akustická fokusace (obrázek 5a.) umístí biologické buňky a další částice dokonce i se širším tunelem do těsného zarovnání. Toto přesné zarovnání buněk umožňuje vyšší vzorkovací frekvence při zachování kvality dat (obrázek 5b.).

V praxi zvyšuje akustická fokusace průtokové cytometrie frekvenci vzorkování buněk přibližně 20× (obrázek 6).

Obrázek 6: Porovnání doby vzorkování pro různá zařízení průtokové cytometrie založená na průtokové cytometrii s fluidním systémem (A, B, C) a cytometrii s akustickou fokusací (D). (Zdroj obrázku: společnost Thermo Fischer Scientific)

Na obrázku 6 používají zařízení od společností A, B a C hydrodynamickou technologii, zatímco společnost D používá průtokový přístup cytometrie s akustickou fokusací.

Získávání dat při průtokové cytometrii s akustickou fokusací

Konstrukce elektroniky pro zařízení průtokové cytometrie s akustickou fokusací vyžaduje vysokorychlostní fotocitlivou elektroniku, aby se přizpůsobila rychlosti krevních buněk a nosné kapaliny skrz trysku s větším průměrem. Výše zmíněný vysokorychlostní zesilovač LTC6268 600 MHz v kombinaci se specializovaným uspořádáním pouzdra rezistoru 0805 přináší rychlost optického snímání až 11,4 MHz (obrázek 7, vlevo). Výstup zesilovače LTC6268 je přiváděn do ADC ADAQ23878 společnosti Analog Devices k digitalizaci.

Obrázek 7: ADC ADAQ23878 digitalizuje optický signál z fotodiody (PD₁) a obvodu TIA (vlevo). (Zdroj obrázku: Bonnie Baker)

Model ADAQ23878 představuje 18bitové přesné, vysokorychlostní řešení získávání dat SIP (system-in-package) s 15 miliony vzorky za sekundu (MSPS). Výrazně zkracuje cyklus vývoje přesných měřicích systémů tím, že přenáší konstrukční zátěž výběru vstupních komponent ovladače, optimalizaci a rozvržení z konstruktéra na zařízení.

Modulární přístup SIP snižuje počet komponent koncového systému tím, že kombinuje více společných bloků pro zpracování a kondiciování signálu v jediném zařízení spolu s vysokorychlostním 18bitovým A/D převodníkem s postupnou aproximací (SAR) s 15 miliony vzorky za sekundu. Tyto bloky zahrnují nízkošumový plně diferenciální zesilovač ovladače ADC a stabilní referenční vyrovnávací paměť.

Řešení ADAQ23878 obsahuje také kritické pasivní součástky, které využívají technologii iPassive společnosti Analog Devices k minimalizaci zdrojů chyb závislých na teplotě a k optimalizaci výkonu. Rychle se ustalující fáze ovladače ADC přispívá k jeho schopnosti zajistit rychlé získávání dat.

Vyhodnocení řešení ADAQ23878 µModule

K vyhodnocení řešení ADAQ23878 poskytuje společnost Analog Devices vyhodnocovací desku EVAL-ADAQ23878FMCZ (obrázek 8). Deska demonstruje výkon řešení ADAQ23878 μModule a je všestranným nástrojem pro vyhodnocování návrhu front-endu průtokové cytometrie a řady dalších aplikací.

Obrázek 8: Vyhodnocovací deska EVAL-ADAQ23878FMCZ pro řešení ADAQ23878 má na desce napájecí obvody, dodává se s přidruženým softwarem k řízení a analýze dat a je kompatibilní s ovladačem SDP-H1. (Zdroj obrázku: společnost Analog Devices)

Vyhodnocovací deska EVAL-ADAQ23878FMCZ vyžaduje počítač se systémem Windows 10 nebo vyšším, nízkošumový přesný zdroj signálu a pásmovou propust vhodnou pro 18bitové testování. Vyhodnocovací deska vyžaduje modul plugin ACE a ovladač SPD-H1 řešení ADAQ23878.

Závěr

Zkoumání vždy jen jedné biologické buňky najednou pomocí standardních technik průtokové cytometrie s hydrodynamickou fokusací bylo úspěšné, ale s potřebou rychlejší analýzy došlo k posunu k technikám založeným na průtokových metodách s akustickou fokusací. Musí se však také zlepšit elektronika podporující pokročilejší průtokovou cytometrii a zároveň minimalizovat prostor, náklady a doba vývoje.

Jak je uvedeno, vysokorychlostní operační zesilovač LTC6268 a přesné vysokorychlostní řešení získávání dat ADAQ233878 μModule lze kombinovat, a vytvořit tak kompletní systém získávání dat pro pokročilé zařízení průtokové cytometrie.